Возможности применения гумусовых кислот в лечении заболеваний мочеполовой системы

Введение

Несмотря на значительные достижения в области диагностики и лечения, заболевания мочеполовой системы (МПС) продолжают оставаться одной из значимых причин снижения качества жизни, инвалидизации и смертности населения, создавая целый ряд проблем социального и экономического характера [1]. Согласно последним исследованиям, ежегодно в мире регистрируется более 150 млн случаев инфекционных и порядка 40 млн случаев — неинфекционных заболеваний МПС, а также около 15 млн смертей от них [2–4].

По прогнозам экспертов, до 2030 года ожидается увеличение распространённости заболеваний МПС на 25%, причём наибольший прирост будет наблюдаться в развивающихся странах, достигнув 46% [5, 6]. Этот прогноз в основном объясняется ростом численности населения и увеличением продолжительности жизни. Тем не менее нарастающие факторы риска, связанные с быстрым экономическим ростом в развивающихся странах, могут ещё больше усугубить данный прогноз [7]. Помимо социально-демографических проблем, заболевания органов МПС имеют и значительные экономические последствия.

По прогнозам, к 2030 году расходы на лечение этих заболеваний в мире достигнут отметки в 100 млрд долларов в год, что значительно превышает текущие показатели — около 40 млрд долларов в год [8, 9]. Это в значительной степени обусловливает актуальность разработки новых лекарственных средств для лечения заболеваний МПС. В связи с этим особый интерес представляют препараты на основе природных соединений и их производных, обладающих высокой терапевтической активностью, широким спектром использования и наряду с этим — благоприятным профилем безопасности.

Одной из наиболее интересных и малоизученных групп природных соединений растительного происхождения являются гуминовые вещества, а именно гумусовые кислоты (ГуК).

Методология поиска источников

Проведён поиск публикаций за 1970–2023 гг. в базах MEDLINE (PubMed Database), SciVerse Scopus, Embase (Elsevier), Cochrane, eLIBRARY.RU, Web of Science Core Collection с использованием комбинаций ключевых слов и логического оператора SQL: (“diseases of the genitourinary system” OR “antitumor” OR “nephroprotective” OR “diuretic” OR “antifungal” OR “antibacterial”) AND (“fulvic acid” OR “humic acid” OR “hymatomelanic acid”).

На основании анализа хронологии научно-исследовательских работ и оценки их актуальности в настоящий обзор включено 55 публикаций, освещающих результаты исследований различных аспектов применения ГуК.

Физико-химические свойства гумусовых кислот

Гумусовые кислоты представляют собой особый класс высокомолекулярных органических азотсодержащих соединений циклического строения и кислотной природы, образующихся в результате постмортальных биогеохимических преобразований.

Это совокупность родственных по химической природе гетерогенных полимеров нерегулярного строения, образующих единый генетический ряд по мере увеличения ароматичности и бензоидности, в котором гиматомелановые кислоты (ГмК) характеризуются выраженными восстановительными свойствами, фульвовые кислоты (ФК) проявляют окислительные свойства, а гуминовые кислоты (ГК) демонстрируют окислительно-восстановительную двойственность [10]. В данном ряду закономерно изменяются электронно-донорные и электронно-акцепторные свойства, а также обуглероженность и среднее значение молекулярной массы.

Основными составляющими элементами ГуК являются кислород (O), углерод (C), водород (H) и азот (N). Различные фракции ГуК значительно отличаются друг от друга по элементному составу, содержанию функциональных групп, физико-химическим свойствам (коэффициенту цветности, растворимости, термодинамическим параметрам и т.п.) и т.д. [11]. При этом эти схожие по строению, но не идентичные гетерогенные полимеры могут образовывать надмолекулярные, полиморфные и полидисперсные системы.

Структура макромолекул ГуК включает в себя ароматическое поликонденсированное ядро; негидролизуемую часть, состоящую из высокозамещённых ароматических фрагментов, которые соединены мостиками (алкильными, эфирными и др.) с различными функциональными группами (карбоксильными, альдегидными, метоксигруппами и др.); периферическую (гидролизуемую) часть, сформированную цепочками боковых радикалов, которые состоят из углеводных, аминокислотных, а также углеводородных фрагментов [12, 13].

Имея однотипное строение, фракции ГуК существенно отличаются многообразием полифункциональных цепей, их содержанием и количественным соотношением в периферической гидрофильной части молекулы, что во многом определяет специфичность действия и реакционную способность.

Многообразные функциональные группы являются обязательной частью макромолекулы и содержат в своём составе как полярные, так и неполярные группы, а именно: фенольные, спиртовые и гидроксихинонные гидроксилы (–OH), кетонные, альдегидные и хинонные карбонилы (>C=O), азогруппы (–N=N–), карбоксилы (–СООН), аминогруппы (–NH2, –NH–, =N–, NR–), пептидные (–CO=NH–), амиды (–CO=NH2), имины (>C=NH), сульфонные (>SO2), тиолы (–SH), сульфиды (>S), метоксильные (–О=СН3), эфиры серной кислоты, соли аммония, аминосахаров и др.

При этом основная каркасная часть тесно соединена с периферийной частью через сопряжённые углеродные связи (–С–С–, –С=С–) или мостики (–О–, –N–, –Н–, –СН2–). В состав ГуК входит не только органическая часть, но и неорганическая, включающая в себя низкомолекулярные зольные компоненты (такие как ионы металлов, оксиды кремния и алюминия) и гигроскопическую влагу. При этом компонентный состав различных фракций ГуК зависит от источника происхождения и способа их выделения.

Специфичность функциональных групп, их физико-химические особенности, свойства и реакционную активность ГуК во многом определяют макромолекулярная структура, присутствие стабильных ароматических структур (углеводородных соединений, углеводородных фрагментов), а также наличие полярных кислородосодержащих групп, гидрофобных и гидрофильных фрагментов. Особенности физико-химической структуры ГуК обеспечивают участие в процессах ассоциации, диссоциации, переноса электронов и окислительно-восстановительных реакциях.

Это во многом определяет свойства ГуК и тип взаимодействия, а именно буферные (кислотно-щелочные, окислительно-восстановительные, изотонические), кислотно-основные (электронно-акцепторные, электронно-донорные), поверхностно-активные и электроповерхностные свойства, а также гидрофобно-гидрофильные и электростатические взаимодействия [14–16]. Как и все полиамфолиты, ГуК способны к образованию множественных (стабильных и динамически лабильных) ионных связей [17].

Совокупность перечисленных факторов предопределяет способность этих кислот к межмолекулярному и межатомному взаимодействию благодаря системе сопряжённых связей (водородных, ионных, ковалентных и координационных), к обмену лигандов, вандерваальсовым силам и гидрофобному связыванию, с последующим образованием новых циклических (хелатных), катионно-анионных комплексов, келоидных и дисперсионных систем с неаддитивными свойствами [18, 19].

Результаты экспериментов подтверждают биологическую активность ГуК и их способность проявлять противовоспалительные, диуретические, антибактериальные, противогрибковые, противоопухолевые, антиоксидантные и мембранотропные свойства. Согласно результатам клинических исследований, ГуК нетоксичны и не обладают тератогенным, мутагенным и канцерогенным действием [20–22].

Способность ГуК к трансформации молекул и веществ с образованием новых полиэлектролитных микро- и нанобиокомпозиций (включая растворы, гели, комплексные соединения и др.), обладающих неаддитивными свойствами и биосовместимыми полимерными оболочками, даёт возможность не только вводить в легкодоступной форме необходимые минералы в организм, но и удалять вредные химические вещества [23]. Всё это позволяет ГуК достигать своих биологических мишеней и реализовывать фармакологическую активность на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Именно поэтому они представляют большой интерес для медицинского использования.

Антибактериальные свойства гумусовых кислот

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) по-прежнему остаются одной из наиболее распространённых патологий среди уронефрологических заболеваний, ежегодно поражая более 100 млн человек во всем мире [24]. Одной из ведущих причин развития ИМП являются бактериальные агенты. Уропатогенная Escherichia coli преобладает в этиологической структуре ИМП и выявляется в 70–80% случаев. Реже встречаются Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., а также Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp. и другие бактерии [25].

При этом заболеваемость ИМП, вызванными уропатогенными штаммами с множественной лекарственной устойчивостью, растёт во всем мире угрожающими темпами, определяя тем самым приоритетность поиска и разработки новых противомикробных препаратов [26, 27]. Исследования показывают, что ГуК способны ингибировать рост широкого спектра микроорганизмов [28–30]. Так, S.W. Leivers и P. Warn [31] оценивали антибактериальную активность ФК в отношении некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

В ходе эксперимента бактериальные суспензии, разведённые в агаре Мюллера–Хинтона, помещали в лунки культурального 96-луночного планшета, которые уже содержали по 100 мкл раствора ФК в различных концентрациях (0,004–2,0%). После этого пробы инкубировали в темноте при 35–37 °C в течение 18–24 ч. В качестве эталонного препарата сравнения использовали ципрофлоксацин (0,03–16,0 мг/мл). Значение минимальной ингибирующей концентрации определяли визуально и с помощью спектрофотометра (табл. 1).

В результате исследования выявлено, что раствор ФК в концентрации ≤0,12% ингибирует рост NDM-, KPC- и ESBL-положительных штаммов K. pneumoniae, а также E. coli, резистентных ко многим антимикробным препаратам. В частности, этот раствор обладает сравнимой эффективностью с ципрофлоксацином, а в ряде случаев (в отношении NDM- и KPCположительных штаммов K. pneumoniae) и превосходит его по соответствующим показателям [31].

Приведённые данные согласуются с результатами экспериментальных исследований Y. Zhao и соавт. [32], которые оценивали чувствительность различных микроорганизмов к 4,6% раствору ФК с помощью метода последовательных микроразведений в бульоне в соответствии с протоколом Института клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) версии M07-A9. Эффективность оценивали через 24 и 48 ч. Результат считался положительным при достижении минимальной ингибирующей концентрации, которая подавляла видимый рост у 50 и 90% исследуемых культур (табл. 2).

В результате анализа чувствительности установлено, что ФК обладают высокой антимикробной активностью в отношении широкого спектра бактериальных организмов, как чувствительных к антибиотикам, так и резистентных к ним, со значениями МИК₅₀ и МИК₉₀, равными или менее 0,125% [32].

По данным ряда исследований, антибактериальная активность ГуК реализуется несколькими путями.

1. Нарушение целостности цитоплазматической мембраны микробной клетки. Поскольку ГуК содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы, они могут фиксироваться на поверхности бактериальной клетки за счёт возникающих электростатических взаимосвязей с такими отрицательно заряженными поверхностными компонентами мембраны, как лизилфосфатидилглицерол, тейхоевые кислоты, липотейховые кислоты — грамположительных бактерий и липополисахариды — грамотрицательных бактерий, при этом образуя сложные макромолекулярные структуры (каналоподобные структуры) [33–35].
2. Хелатирование металлов. ГуК способны связывать ионы металлов, образуя хелатные комплексы за счёт многочисленных функциональных групп (фенольных, гидроксильных, карбоксильных, карбонильных и аминогрупп), увеличивая проницаемость и дестабилизацию внешних структур бактериальной клетки, а также ингибирование ряда метаболических процессов [36, 37].
3. Ингибирование бактериальных ферментов. Результаты исследований свидетельствуют о том, что ГуК способны нейтрализовывать бета-лактамазы (ферменты, служащие катализатором гидролиза бета-лактамного кольца пенициллинов и цефалоспоринов и предотвращающие таким образом их антибиотическое действие на микроорганизмы) бактерий за счёт связывания с аллостерическим сайтом белка TEM-1 [38, 39].

Таким образом, комбинация этих взаимодополняющих, но разных механизмов антибактериального действия является одной из причин действенности ГуК в отношении широкого спектра микроорганизмов и препятствием к возникновению резистентности со стороны бактериальных патогенов.

Противогрибковые свойства

Несмотря на то, что в большинстве случаев ИМП вызваны бактериями, многие исследования указывают на возрастающую долю грибковых патогенов в структуре нозокомиальных инфекций МПС, при этом возрастает и частота выявления штаммов грибов, резистентных к основным противогрибковым препаратам [40–42]. Отмечается, что одну из ключевых ролей в развитии грибковых ИМП играет предшествующая цитостатическая или антибактериальная терапия [43–45].

Сокращение эндогенной бактериальной флоры вследствие применения антибиотиков способствует усилению грибковой колонизации эпителиальных поверхностей и облегчает доступ к нижним мочевым путям, особенно при наличии уретрального катетера [46–48]. Исследования показывают, что ГуК помимо антибактериальной активности обладают выраженным антимикотическим действием [49–51].

Данная информация подтверждается ранее упоминавшейся работой Y. Zhao с соавт. [32], в которой оценивалась чувствительность различных грибковых микроорганизмов к 4,6% раствору ФК с помощью метода последовательных микроразведений в бульоне в соответствии с протоколами CLSI версий CLSI M38-A2 — для Aspergillus spp. и CLSI M27-A3 — для Candida spp. (табл. 3). В результате исследования выявлено, что раствор ФК обладает высокой эффективностью в отношении широкого спектра грибковых микроорганизмов со значениями МИК₅₀ и МИК₉₀, равными или менее 0,5% [32].

При этом экспериментально доказано, что эффективность ФК сопоставима со стандартными препаратами, используемыми для лечения ИМП. L. Sherry и соавт. [52] сравнивали эффективность применения ФК и классических противогрибковых препаратов (амфотерицин B, вориконазол и каспофунгин) в отношении C. albicans. Чувствительность планктонных клеток определяли с использованием метода последовательных микроразведений в бульоне в соответствии с протоколом CLSI версии M-27A.

Минимальную ингибирующую концентрацию для микроорганизмов в составе биоплёнок вычисляли с использованием анализа восстановления XTT (2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[карбонил (фениламино)]-2H-гидроксид тетразолия). Все измерения проводили в трёх повторностях (табл. 4).

Как видно из представленных данных [52], C. albicans была чувствительна ко всем тестируемым соединениям с МИК₉₀ для планктонных форм, равной 0,125%. При этом установлено, что ФК достигала максимального элиминирующего эффекта быстрее остальных соединений (через 120 мин от начала тестирования: ФК=89%, амфотерицин В=61%, вориконазол=18%, каспофунгин=–2%). По данным XTT-теста, снижение жизнеспособности биоплёночных форм C. albicans при воздействии ФК происходило при МИК₅₀ и МИК₉₀, равных 0,25 и 0,5% соответственно.

На основании анализа полученных результатов авторами работы [52] сделано предположение о том, что ФК обладает неспецифической активностью в отношении клеточной мембраны C. albicans. Для подтверждения данного высказывания проведена оценка проницаемости мембраны для аденозинтрифосфата (АТФ) с применением методов флуоресцентной микроскопии. В результате выявлено, что высвобождение АТФ достигало максимума спустя 40 мин после воздействия ФК. Эти наблюдения были подтверждены путём анализа поглощения йодида пропидия (PI) с помощью покадровой микроскопии.

Установлено, что уже через 10 мин после добавления ФК все клетки становились PI-положительными, а клеточный рост замедлялся. Таким образом, результаты данных исследований дают основание утверждать, что ГуК могут служить потенциальными антисептическими средствами для лечения заболеваний, вызванных грибковыми инфекциями.

Антипролиферативные и противоопухолевые свойства

В последние годы также установлено, что ГуК обладают противоопухолевой активностью [53–55]. Это подтверждается работой T. Sekerler с соавт. [56], в которой оценивалась цитотоксическая активность ГК в отношении опухолевых клеток рака предстательной железы PC3. В ходе эксперимента клетки обрабатывали различными концентрациями (5, 10, 25, 50 и 100 мкг/мл) ГК и оценивали их выживаемость посредством MTT-анализа, а также миграционную активность — с помощью скретч-тестов.

По результатам анализа выживаемости установлено, что ГК оказывала цитотоксический эффект в отношении клеточной линии рака предстательной железы PC3 с IC50=67,9 мкг/мл. При этом также отмечено, что ГК значительно снижала миграционную активность опухолевых клеток, демонстрируя дозозависимый эффект [56]. Приведённые данные согласуются с результатами других исследований, в которых также отмечалась проапоптотическая активность ГуК в отношении клеточных линий рака предстательной железы PC3 (андроген-независимой опухоли) и LNCaP (андрогензависимой опухоли) [57, 58].

Противоопухолевое действие ГуК в отношении рака мочевого пузыря изучалось в исследовании T. Kloskowski с соавт. [59] на клеточных линиях T24 и 5637.

В ходе исследования клеточные линии карциномы мочевого пузыря обрабатывали различными концентрациями минеральной смолы (МС), содержащей в своем составе порядка 75–80% гуминовых веществ — ГК, ФК и гумина, и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч, после чего оценивали цитотоксическое действие и клеточный рост в реальном времени с помощью MTT-теста и клеточного анализатора, а также анализировали клеточный цикл и количество клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза посредством проточной цитометрии.

Выявлено, что МС оказывала цитотоксическое действие на оба типа клеток, демонстрируя дозо- и времязависимый эффект с летальной концентрацией (ЛК90) для T24=3103 и 5637=6640 мкг/мл. Анализ клеточного цикла показал, что обработка МС останавливала клеточный цикл в G0/G1- и S-фазе, снижая число жизнеспособных клеток при увеличении концентрации [59]. Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о том, что механизм противоопухолевого действия ГуК может реализовываться двумя путями.

1. Перегрузка кальцием и индукция окислительного стресса. Поскольку ГуК представляют собой полидисперсную смесь гетерогенных полиэлектролитов, они могут адсорбироваться на клеточных плазматических мембранах, индуцируя образование активных форм кислорода за счёт прямого стимулирующего действия на клеточные рецепторы. При этом также отмечается, что ГуК способны повышать проницаемость клеточной мембраны для внеклеточных ионов Ca²⁺. Предполагается, что влияние ГуК на образование оксида азота (NO) связано с ранее опубликованными данными о Ca²⁺-зависимой продукции эндотелиальной оксид-синтазы азота (iNos) [60, 61]. При этом в исследованиях отмечается, что ФК и ГК проявляют фазоспецифичность, действуя на опухолевые клетки в фазе G0/G1 [62, 63].
2. Ингибирование эпигенетических механизмов. Помимо прямого действия на опухолевые клетки через инициацию процесса апоптоза ГуК способны ингибировать ряд эпигенетических механизмов, отвечающих за рост, развитие и метастазирование опухоли. Экспериментально доказано, что ГуК могут ингибировать экспрессию онкогенной микроРНК-21, регулирующей экспрессию нескольких связанных с раком генов-мишеней, таких как PTEN, TPM1 и PDCD. При этом показано, что ГуК оказывали индуцирующее действие на экспрессию микроРНК-22, являющейся супрессором опухолевого роста [64].

Исходя из представленных данных, можно сказать, что ГуК способны комплексно воздействовать на опухолевые клетки, задействуя как прямые, так и опосредованные пути апоптоза и при этом оказывая влияние на сигнальные и эпигенетические механизмы.

Нефропротективные и диуретические свойства

Помимо противомикробной и противоопухолевой активности, ГуК также обладают диуретическими и нефропротективными свойствами, что подтверждается многочисленными исследования как отечественных, так и зарубежных учёных [65–67]. Так, в работе А.В. Дубищева и Л.Е. Меньших [68] оценивалась диуретическая активность ГуК на животной модели. В ходе эксперимента крысам парентерально вводили препараты ГК, ФК и ГмК в дозе 5 мг/кг на фоне 3% внутрижелудочной водной нагрузки. Затем животных помещали в обменные клетки и в течение следующих суток собирали мочу.

Экскрецию Na+ и K+ определяли с помощью пламенной фотометрии, а креатинина — фотоэлектроколориметрическим методом. В результате установлено, что применение ГК способствовало росту диуреза (с 1,22±0,12 до 1,58±0,12 мл/сут) и натриуреза (с 113,09±19,51 до 191,68±24,63 мкМ/сут). При этом отмечалось, что выведение калия (с 92,73±8,67 до 69,3±3,07 мкМ/сут) и креатинина (с 2,38±0,25 до 1,65±0,19 мг/сут) уменьшалось.

ГмК отчётливо стимулировала выведение из организма воды (с 1,07±0,01 до 2,24±0,25 мл/сут), креатинина (с 1,74±0,09 до 4,41±0,74 мг/сут) и Na+ (с 112,44±10,38 до 301,24±48,06 мкМ/сут), угнетая выделение K+ (с 49,76±4,68 до 23,47±4,68 мкМ/сут). Однако применение ФК не приводило к статистически значимому изменению показателей [68]. Полученные результаты согласуются с исследованиями других авторов, где также было показано, что ГуК оказывают выраженное стимулирующее действие на экскреторную функцию почек, при этом демонстрируя калийсберегающий эффект [69, 70].

Нефропротективные свойства ГК изучались в исследовании A. Akbas с соавт. [71] на модели ишемии-реперфузии почки (ИРП). В ходе эксперимента крысы линии Wistar (n=21) были подразделены на три равные группы (1-я группа — контроля (неишемическая), 2-я группа — ИРП и 3-я группа — ИРП + ГК в дозе 10 мг/кг за 1, 12 и 24 ч до процедуры).

Для индуцирования ишемии левую почечную артерию пережимали на 60 мин, затем жгут снимали и проводили реперфузию в течение часа, после чего производили забор крови из брюшной аорты для оценки общего антиоксидантного статуса (ОАС), общего окислительного статуса (ООС), уровня окислительного стресса (УОС) и ишемически-модифицированного альбумина (ИМА). Затем крыс анестезировали внутрибрюшинным введением ксилазина в дозе 5 мг/кг и кетамина гидрохлорида в дозе 50 мг/кг с целью проведения левосторонней нефрэктомии и последующего забора материала для гистопатологического и иммуногистохимического анализа.

Биохимический анализ показал, что значение ООС (14,29 и 22,52; р <0,05), УОС (6,99 и 18,62; р <0,05) и ИМА (0,600 и 3,438; р <0,05) были значительно ниже в группе ИРП + ГК, при этом уровень ОАС (2,21 и 1,23; р <0,05) оказался повышен.

В ходе гистопатологического исследовании выявлено, что применение ГК приводило к значительному снижению размеров почечных канальцев (0,43 и 1,57; р <0,05) и капсулы Боумена–Шумлянского (1,42 и 2,14; р <0,05), уменьшению повреждения (0,57 и 1,57; р <0,05) и некроза канальцевого эпителия (1,43 и 2,14; р <0,05), а также снижению выраженности интерстициальной инфильтрации (0,57 и 0,86; p >0,05) по сравнению с группой ИРП. Иммуногистохимический анализ показал, что количество апоптотических клеток в поле зрения (112 и 251; р <0,05) было значительно меньше в группе с применением ГК [71].

Заключение

На сегодняшний день накоплен достаточный объём исследований, свидетельствующих о разнообразии химических и биологических эффектов гумусовых кислот. Отмечается, что они обладают выраженной противоопухолевой и противомикробной активностью, а также способны обладать антиоксидантными, нефропротективными и диуретическими свойствами, при этом проявляя синергизм с другими природными и синтетическими фармакологическими средствами.

Выявленный спектр фармакологических эффектов в будущем может позволить дополнить существующие методы лечения, повысив их эффективность, или разработать новые терапевтические подходы к лечению заболеваний мочеполовой системы. Проведённый анализ демонстрирует актуальность дальнейшего изучения гумусовых кислот с целью более детального выяснения их механизмов действия, фармакокинетики и возможных побочных эффектов, а также синтеза их структурных аналогов с целью создания новых лекарственных препаратов.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Вклад авторов. Н.С. Бендерский — идея рукописи, поиск литературных источников, написание статьи, окончательное редактирование рукописи; Л.А. Болурова, Н.Р. Юсупова, Д.В. Березовская, Е.Е. Попова, Г.Г. Яковлев, М.В. Гайворонцев, Я.В. Ходосенко, И.Э. Джемолдинова — поиск литературных источников, редактирование текста, написание статьи.

Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.